益生菌群維持腸道健康的分子機(jī)制閱讀次數(shù) [7765] 發(fā)布時(shí)間 :2016-04-10
益生菌群維持腸道健康的分子機(jī)制
黃東彥，朱劍鋒，胡學(xué)華，胡學(xué)生，周海泳，龐旭，胡文鋒
摘要
益生菌的益生效果在過去已經(jīng)得到大量的動(dòng)物試驗(yàn)證明，但對(duì)于其益生作用的分子機(jī)制的研究尚不能完全滿足指導(dǎo)實(shí)踐應(yīng)用，益生菌制劑的益生效果不穩(wěn)定、不顯著的問題仍存在。近年來大量針對(duì)益生菌及腸道細(xì)胞、益生菌對(duì)致病菌和益生菌對(duì)疾病的相互作用機(jī)制進(jìn)行了研究，并取得了一些成果。本文綜述了以上三方面作用機(jī)制研究的進(jìn)展。
1前言
人類對(duì)于腸道益生菌群的研究歷史非常久遠(yuǎn)，盡管如此，針對(duì)腸道健康的發(fā)酵產(chǎn)品直到20世紀(jì)初才開始深入研究。在諾貝爾獎(jiǎng)得主Metchnikoff提出益生菌概念后，益生菌倍受人們關(guān)注，研究的方面包括提高消化能力、供給營(yíng)養(yǎng)、抵御致病菌和菌體自身作為抗體的功能等等。但過去的研究大多處于宏觀試驗(yàn)階段，益生菌的益生機(jī)理尚未完全研究清楚，尤其是基因激活調(diào)控方面還有廣闊的研究空間。而在21世紀(jì)初，隨著分子生物技術(shù)手段的發(fā)展，腸道益生菌群的作用機(jī)理得到更多的研究，從體內(nèi)試驗(yàn)轉(zhuǎn)為體外試驗(yàn)，從而對(duì)益生菌群與腸道細(xì)胞的互相作用機(jī)制、益生菌對(duì)致病菌的屏障作用等等獲得深入的研究成果，本文將對(duì)這些新成果進(jìn)行簡(jiǎn)述并分析未來的研究方向。
2益生菌群與腸道細(xì)胞相互作用機(jī)制的研究
對(duì)于腸道細(xì)胞，由于其組成的復(fù)雜性使體外研究長(zhǎng)時(shí)間處于探索體外培養(yǎng)技術(shù)的階段，而近年來由于腸道細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的成熟，研究者們開始針對(duì)研究腸道益生菌群和各種不同的細(xì)胞間的關(guān)系。
2.1益生菌群對(duì)腸道上皮細(xì)胞的激活作用
腸道上皮表面積約400平方米，且長(zhǎng)時(shí)間與大量腸道微生物接觸，與腸道益生菌群時(shí)刻保持接觸交流，因此腸道上皮細(xì)胞是保持腸道微生態(tài)平衡的關(guān)鍵之一（McCole and Barrett, 2007）。對(duì)于很多腸道疾病，越來越多的證據(jù)證明腸道菌群對(duì)調(diào)節(jié)腸道免疫應(yīng)答有著重要的作用，例如可能存在某些識(shí)別特定微生物成分的基因表達(dá)程序可抵御微生物威脅（Sansonetti, 2004），如尾相關(guān)同源異型域蛋白（Caudal-relate homeodomain protein, Cdx2）和肝臟核因子1α（hepatic nuclear factor 1α, HNF1α）等（Mitchelmore et al., 2000）。
有研究稱存在一類哺乳動(dòng)物模式識(shí)別受體(mammalian pattern recongition receptors, PRRs)可以識(shí)別細(xì)菌和病毒的外形結(jié)構(gòu)從而激活前炎癥代謝途徑，其中三種PRRs尤為受關(guān)注。一種為類鐘形受體（Toll-like receptors, TLRs）；另一種為核苷酸結(jié)合寡聚域分子（nucleotide-binding oligomerizetion domain molecules, Nod）；還有一種為C型外源凝集素（C-type lectins, CLRs）。TLR、Nod和CLRs均具有識(shí)別菌體表面蛋白的能力，相比之下，TLR的調(diào)節(jié)作用更為明顯。TLR通常與細(xì)胞膜密切相關(guān)，一般擁有外露的富亮氨酸重復(fù)識(shí)別域和胞內(nèi)白細(xì)胞間介素受體（interleukin-0000
1 receptor, IL-1R）識(shí)別域，例如TLR4可識(shí)別革蘭氏陰性菌（G-）細(xì)胞壁的脂多糖（LPS），TLR5則可以識(shí)別細(xì)菌的鞭毛蛋白（flagellin）。而這種識(shí)別能力可調(diào)節(jié)某些代謝途徑，如上皮細(xì)胞識(shí)別TLR2或TLR9的結(jié)合體可以增加腸道屏障層的保護(hù)作用（Cario et al. 2004）。
通過對(duì)TLR系列蛋白的研究，表明TLR與Nod能激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB（Nuclear factor κB），從而激活受NF-κB控制的前炎癥基因的表達(dá)（Dupraz et al., 2000）。Kelly等發(fā)現(xiàn)當(dāng)腸炎沙門菌Salmonella enteritidis被TLR識(shí)別后，可通過IkB激酶（IkB kinase, IKK）激活NF-κB，從而使RelA基因表達(dá)；同時(shí)還發(fā)現(xiàn)益生菌群中的多形擬桿菌Bacteroides thetaiotaomicron可減緩炎癥基因的過度表達(dá)，如圖1。
圖1 TLR與激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的作用機(jī)制（Kelly et al., 2005）
關(guān)于TLR和Nod的作用有大量的小鼠動(dòng)物試驗(yàn)也得到類似的結(jié)果，而結(jié)果證明TLR對(duì)腸道免疫細(xì)胞的作用更大，能激活T細(xì)胞及Th（T helper）細(xì)胞免疫相關(guān)的IL-1β和IL-6等。而體外試驗(yàn)方面，菌株與腸道細(xì)胞系共培養(yǎng)結(jié)合Real time PCR的技術(shù)使用較多。Romanin等（Romanin et al., 2010）利用Invitrogen公司的Lipofectamine 2000熒光檢測(cè)系統(tǒng)轉(zhuǎn)染人源腸道上皮癌細(xì)胞系Caco-2，其中的熒光素酶的表達(dá)受3X-κB啟動(dòng)子（NF-κB控制的基因之一）控制，和TLR5組合使用可以用于檢測(cè)可以激活腸道細(xì)胞的微生物。通過這種方法篩選出來的24株酵母和23株細(xì)菌，再利用Sougioultzis在2006年使用過的細(xì)胞接觸培養(yǎng)法共培養(yǎng)菌株與重組的Caco-2細(xì)胞系，利用小鼠腸道環(huán)結(jié)扎模型和Real time PCR檢測(cè)相關(guān)益生基因的表達(dá)量變化（Sougioultzis, 2006）。結(jié)果表明酵母K. Marxianus CIDCA 8154能高效提高熒光蛋白CCL20的表達(dá)量，同時(shí)很多前炎癥因子如IL-1β和TNF-α等的表達(dá)量也有大幅度提高，從而表現(xiàn)出菌株對(duì)腸道細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制。
另外，對(duì)于可以減弱腸道發(fā)炎癥狀的誘導(dǎo)型—氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase, iNOS）和發(fā)炎調(diào)節(jié)劑過氧化物酶體增殖激活受體γ（peroxisome proliferators-activated receptor-gamma, PPAR-γ）等也是益生菌免疫調(diào)節(jié)機(jī)制的研究熱點(diǎn)，但其作用主要為輔助作用（Zanello et al., 2009）。
而腸道上皮細(xì)胞的研究方法已經(jīng)發(fā)展出一些較為成熟的系統(tǒng)：常用的動(dòng)物腸道細(xì)胞系有Caco-2、HT-29、HCT116以及HeLa等；培養(yǎng)基多數(shù)選用DMEM或RPMI配合5%-10%小牛血清；檢測(cè)基因表達(dá)的微矩陣基因芯片有人類細(xì)胞因子表達(dá)矩陣等，而除了常規(guī)的粘附培養(yǎng)搭配細(xì)胞表面定植培養(yǎng)法，還有半透膜雙層隔離共培養(yǎng)法等新技術(shù)，減少不確定的復(fù)雜成分影響（Maaser et al., 2001），跨細(xì)胞上皮電阻法（transepithelial electrical resistance, TER）測(cè)定上皮細(xì)胞狀況反映腸道屏障功能等等（Klingberg et al., 2005）。這些研究技術(shù)對(duì)于現(xiàn)今得到的成果作出了不少的貢獻(xiàn)，是技術(shù)瓶頸的突破。
2.2益生菌群對(duì)腸道粘膜細(xì)胞免疫的促進(jìn)作用
腸道粘膜是腸道的主要免疫系統(tǒng)區(qū)域，其中有系統(tǒng)的淋巴組織如派伊爾氏淋巴集結(jié)（Peyer's patch, PP）等起著至關(guān)重要的作用。大量研究表明，粘膜細(xì)胞分泌的免疫球蛋白SIgA與益生菌群的關(guān)系密切（Hapfelmeier et al., 2010）；人們也通過對(duì)IgA的代謝途徑研究益生菌群對(duì)腸道粘膜細(xì)胞的免疫促進(jìn)機(jī)理，經(jīng)典的模型如圖2。這個(gè)模型認(rèn)為益生菌群激活粘膜細(xì)胞中的T細(xì)胞與B細(xì)胞，使它們表達(dá)α4β7 整聯(lián)蛋白且開始遷移到血液中；同時(shí)膜中層的漿細(xì)胞（plasma cell）每天分泌3-5g的SIgA抵御腸道致病物質(zhì)的侵害。
圖2 腸道粘膜細(xì)胞免疫機(jī)制（Thomas et al., 2005）
粘膜細(xì)胞中的CD4+ T細(xì)胞、CD8+ T細(xì)胞、Th17細(xì)胞、Treg細(xì)胞（Lee, 2010）巨噬細(xì)胞（Ivec et al., 2007）、樹突狀細(xì)胞（Dendritic cells, DCs）和嗜酸性細(xì)胞等都是人們密切關(guān)注的研究對(duì)象（Foligne et al., 2007）；而上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞（intraepithelial lymphocytes, IEL）為最新的熱門研究對(duì)象，IEL的功能尚未清楚，但很可能與腸道腫瘤監(jiān)視有關(guān)。針對(duì)IEL的轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)試驗(yàn)也證明IEL的重要地位，下一步將進(jìn)行深入的體外試驗(yàn)研究。
2.3益生菌群對(duì)腸道細(xì)胞的保護(hù)作用
益生菌群對(duì)腸道損傷的修復(fù)作用是研究較為缺乏的方面，但最近Wallace等在2010年研究利用大腸桿菌中的β-葡萄糖醛酸酶抑制劑（β-glucuronidase inhibitor）減輕抗癌藥物CPT-11的腹瀉副作用時(shí)，發(fā)現(xiàn)其中一種抑制劑存在保護(hù)腸道免受損傷功能（Wallace et al., 2010）。
CPT-11引起腹瀉的代謝途徑和四種β-葡萄糖醛酸酶抑制劑的結(jié)構(gòu)如圖3所示。針對(duì)這個(gè)代謝途徑，β-葡萄糖醛酸酶抑制劑可中斷SN-38G轉(zhuǎn)變?yōu)橐鸶篂a的SN-38，動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)的腸道切片透射電子顯微照片證明這個(gè)方法能有效保護(hù)腸道。
圖3 CPT-11引起腹瀉的代謝途徑及β-葡萄糖醛酸酶抑制劑的結(jié)構(gòu)（Wallace et al., 2010）
另外，Pagnini等也通過研究一種益生菌復(fù)合制劑VSL#3（含8種益生菌）的藥用功能證明：VSL#3能通過誘導(dǎo)腸道細(xì)胞生產(chǎn)TNF-α和激活NF-κB從而保護(hù)腸道細(xì)胞的絨毛結(jié)構(gòu)完整，同時(shí)發(fā)現(xiàn)VSL#3可以使腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，使嬰兒雙歧桿菌（Bifidobacterium infantis）和噬熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）明顯增加，腸道平衡環(huán)境更為穩(wěn)定。另外鼠李糖乳桿菌GG（Lactobacillus rhamnosus GG）的菌毛中發(fā)現(xiàn)含有人類粘液結(jié)合蛋白，也可能與腸道修復(fù)相關(guān)（Kankainen et al., 2009）。
對(duì)于腸道損傷的防御與修復(fù)機(jī)制仍然知之甚少，體內(nèi)試驗(yàn)的影響因素過多，而體外試驗(yàn)難以模擬受損過程，技術(shù)上仍有待完善，但益生菌群在這方面的功能一定將會(huì)得到更深入的研究。
3益生菌對(duì)致病菌的屏障作用
3.1益生菌的強(qiáng)粘附能力競(jìng)爭(zhēng)抑制致病菌
益生菌在腸道上的強(qiáng)粘附能力一直是益生菌益生作用之一，人們對(duì)其研究相對(duì)較為深入。益生菌群分泌的一系列粘附成分如脂多糖、多糖A、脂磷壁酸和肽聚糖等能刺激腸道上皮細(xì)胞厚度增長(zhǎng)，主要包, 括粘蛋白如Muc2表達(dá)，同時(shí)對(duì)多種白細(xì)胞間介素基因的表達(dá)有抑制和刺激作用。植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum 299v）被證實(shí)能增加Muc2的表達(dá)量且抑制致病菌粘附（Wlodarska, 2010），其原理如圖4。微生物相關(guān)分子模式（microbe-associated molecular patterns, MAMPs）是益生菌粘附作用的核心，通過這種模式的分子擴(kuò)散使腸道上皮細(xì)胞層中的杯形細(xì)胞分泌Muc2蛋白，從而增加益生菌的粘附效果并抵抗致病菌粘附。
圖4 益生菌群粘附作用與抑制致病菌的機(jī)制（Wlodarska, 2010）
小鼠體內(nèi)攻毒試驗(yàn)證明了益生菌的粘附抗菌作用的效果，而且其作用機(jī)理也得到較深入的研究，這些成果將對(duì)防治腸道炎癥疾病提供依據(jù)。
3.2益生菌分泌抗菌物質(zhì)
過去對(duì)于益生菌分泌抗菌物質(zhì)的研究多數(shù)為酸性物質(zhì)，如乳酸、乙酸、丙酸和正丁酸等，以及抗菌肽及胞外多糖。通常我們簡(jiǎn)單地認(rèn)為，這些有機(jī)酸通過降低腸道pH值而發(fā)揮作用。但這種通過降低pH值的機(jī)制尚不能很好地解釋其代謝產(chǎn)物與致病菌的密切作用。
一種名為表面層蛋白或S層蛋白（Surface layer protein, Slp）的抗菌功能逐漸引起關(guān)注。浙江大學(xué)的Chen等利用大腸桿菌O157:H7（Escherichia coli O157:H）和鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）證明：卷曲乳桿菌ZJ001（Lactobacillus crispatus ZJ001）中的S層蛋白能競(jìng)爭(zhēng)性驅(qū)除致病菌定植腸道（Chen, 2006）。Johnson等在瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus）中提取S層蛋白也能抵御大腸桿菌O157:H7的定植（Johnson, 2006）。
Konstantinov等發(fā)現(xiàn)嗜酸乳桿菌S層蛋白A基因敲除突變株與天然嗜酸乳桿菌對(duì)比抗菌能力明顯下降，其原因與腸道樹突狀細(xì)胞和T細(xì)胞有關(guān)，而且通過純化S層蛋白A經(jīng)體外試驗(yàn)驗(yàn)證其猜想（Konstantinov et al., 2008）。針對(duì)乳桿菌的S層蛋白的研究成果還未能很好地解釋其抑制致病菌的機(jī)制，但在這些基礎(chǔ)上繼續(xù)進(jìn)行深入研究也能很好地指導(dǎo)乳酸菌產(chǎn)品的開發(fā)與應(yīng)用。
Fududa等（2011）研究雙歧桿菌保護(hù)腸道免受致病菌感染的分子機(jī)制時(shí)發(fā)現(xiàn)，雙歧桿菌通過產(chǎn)生乙酸預(yù)防致病菌感染。一些出現(xiàn)在特定雙歧桿菌中的ATP結(jié)合卡帶式碳水化合物轉(zhuǎn)移子的編碼基因可以為試驗(yàn)鼠提供保護(hù)，防止小鼠感染大腸桿菌O157:H7致死。這一影響作用至少部分歸因于乙酸產(chǎn)量的增加，以及大腸桿菌O157:H7志賀毒素從腸腔到血液的轉(zhuǎn)移途徑的中斷。作者推測(cè)，由提供保護(hù)作用的雙歧桿菌產(chǎn)生的乙酸改善了腸道由上皮細(xì)胞介導(dǎo)的防御作用，從而保護(hù)宿主免受致死性感染。
4益生菌群治療腸道疾病的機(jī)制
4.1益生菌群與炎癥性腸病的關(guān)系
炎癥性腸病（inflammatory bowel disease, IBD）是熱門研究課題之一，尤其是利用益生菌群防治IBD方面有大量的研究成果。IBD中最為典型的有潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis, UC）和克羅恩氏?。–rohn’s disease, CD）。益生型大腸桿菌Nissle 1917（Escherichia colistrain Nissle 1917）是研究最為深入的IBD治療用菌種之一（Rao et al., 2005），在研究其臨床應(yīng)用的過程中證明：它的治療機(jī)制是通過TLR-2識(shí)別系統(tǒng)減少促炎細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ和TNF-α的表達(dá)，同時(shí)提高IL-10、IL-8和IL-1β的分泌量，而且對(duì)于治療潰瘍性結(jié)腸炎有顯著的效果（Schultz, 2008）。另外前文提到的VSL#3益生菌復(fù)合制劑也有治療克羅恩氏病的報(bào)道，Pagnini等利用VSL#3完全防御了SAMP小鼠的克羅恩氏結(jié)腸炎攻毒模型，通過RT-PCR檢驗(yàn)證明也是與TNF-α和NF-κB有關(guān)。
此外，益生菌群中的大腸桿菌分泌的吲哚也有可能是治療IBD的機(jī)制之一。Bansal等發(fā)現(xiàn)益生大腸桿菌可將L-色氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榇罅窟胚?，通過高濃度的吲哚和群體感應(yīng)信號(hào)分子SdiA（quorum sensing signals）可抑制腸出血型大腸桿菌(enterohemorrhagic E. Coli, EHEC)，同時(shí)減弱EHEC對(duì)腎上腺素和正腎上腺素的趨向性。通過全轉(zhuǎn)錄組分析法分析吲哚與HCT-8細(xì)胞系的作用發(fā)現(xiàn)，緊密連接蛋白、間隙連接蛋白、粘蛋白和50種細(xì)胞骨架蛋白的表達(dá)量上升，使EHEC的定植率下降，從而減少IBD的傷害（Bansal et al., 2010）。
益生菌群治療腸道疾病的研究十分豐富，對(duì)多種疾病的治療機(jī)理的研究也基本探明，但由于疾病的演變速度很快，防治不同的疾病需要不同的機(jī)制，因此仍然需要繼續(xù)研究，尤其是針對(duì)新型致病菌的治療。
4.2益生菌群與腸道生態(tài)失調(diào)
腸道生態(tài)失調(diào)（dysbiosis）是近年倍受重視的一種非感染性疾病，如多發(fā)性硬化癥（multiple sclerosis, MS）、I型糖尿病（type 1 diabetes, T1D）和風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis, RA）等。
Wu和Lee提出一個(gè)益生菌群與腸道生態(tài)的相互作用機(jī)制，如圖5。其中分節(jié)絲狀菌（segmented filamentous bacteria, SFB）和脆弱擬桿菌（Bacteroides fragilis）是兩個(gè)重點(diǎn)關(guān)注的對(duì)象。該理論認(rèn)為：分節(jié)絲狀菌SFB可以激活并增加Th17細(xì)胞活性和數(shù)量，提高促炎因子的表達(dá)；而脆弱擬桿菌可以調(diào)節(jié)Treg細(xì)胞，起到抗炎作用。當(dāng)分節(jié)絲狀菌和脆弱擬桿菌處于平衡狀態(tài)時(shí)，促炎因子和抗炎因子的表達(dá)量維持在最優(yōu)狀態(tài)，免疫系統(tǒng)活性處于穩(wěn)定的狀態(tài)，即使加上特異性自身免疫突變（autoimmune-specific mutation）這類引起風(fēng)濕等疾病的突變，也可以避免疾病發(fā)生。但當(dāng)分節(jié)絲狀菌這類促炎菌群過多，或者脆弱擬桿菌這類抗炎菌群缺乏等都會(huì)引起生態(tài)失調(diào)（Lee et al., 2010）（圖5）。
圖5 益生菌群與生態(tài)失調(diào)機(jī)制（Lee et al., 2010）
這個(gè)機(jī)制的理論雖然仍處于初級(jí)階段，但它是一個(gè)重要的突破，即益生菌過多或過少都會(huì)造成疾病，即對(duì)益生菌概念的挑戰(zhàn)。只有在益生菌群處于平衡的狀態(tài)下才可以稱為益生菌，否則為中立菌或致病菌。在這個(gè)方向需要進(jìn)行更深入的研究，但這個(gè)機(jī)制對(duì)益生菌的廣譜功能有很大的指導(dǎo)作用。
5小結(jié)
總體來說，對(duì)于益生菌群維持腸道健康的機(jī)制的研究已得到較深入的基礎(chǔ)成果，過去的宏觀機(jī)制研究豐富，而近年來的分子機(jī)制研究也取得了不少的進(jìn)展，尤其是腸道特定細(xì)胞與特定菌種之間的互作機(jī)制研究最為深入，如激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB為核心的TLR和Nod等因子的大量研究使益生菌作用于免疫系統(tǒng)的機(jī)理得以闡明。
盡管益生菌免疫調(diào)節(jié)的研究較豐富，但對(duì)于益生菌分泌針對(duì)腸道細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子的研究則鮮有報(bào)道。隨著研究的深入，人們對(duì)益生菌的益生機(jī)理將有更深刻的理解。在腸道菌群已被稱為“人類的器官”的今天，腸道益生菌群的生態(tài)平衡機(jī)理有重要的研究?jī)r(jià)值，益生菌的其他調(diào)節(jié)機(jī)制也需進(jìn)一步研究，從而指導(dǎo)人們制造出穩(wěn)定、有效及安全的益生菌制劑。
參 考 文 獻(xiàn)(略)